Автор Коротеев Александр задал вопрос в разделе Естественные науки
Как производится дифференциальное окрашивание хромосом? и получил лучший ответ
Ответ от Елена Казакова[гуру]
Около четверти века назад в практику хромосомного анализа стали широко входить методы дифференциального окрашивания хромосом. Впервые метод был предложен Касперссоном, который показал, что при обработке препаратов митотических хромосом с помощью флуорохрома акрихиниприта во флуоресцентном микроскопе видны поперечные светящиеся полосы (бэнды) , расположение которых характерно для каждой хромосомы. Этот прием цитологического анализа в сочетании с генетическими наблюдениями уже в настоящее время позволил начать составление хромосомных карт человека, то есть находить места расположения генов на определенных участках хромосом. Молекулярные механизмы такой специфической окраски до сих пор еще не ясны, многие исследователи способность отдельных участков хромосом к окрашиванию связывают с их химическими различиями. Большое число наблюдений говорит о том, что избирательное окрашивание связано с локализацией так называемого гетерохроматина, ДНК которого обогащена А-Т парами оснований. Центральной задачей при проведении цитогенетического анализа является определение кариотипа. Кариотипирование - это отправная точка всего исследования, определяющая возможность применения всех остальных методических подходов. Исследование набора хромосом в наиболее общей форме можно провести, используя различные методики рутинного окрашивания, при котором все хромосомы приобретают одинаковый цвет, равномерно распределенный по их длине. Такой метод позволяет определять количественные нарушения кариотипа, а также выявлять некоторые маркерные хромосомы без уточнения их происхождения. Поскольку такой подход мало информативен, основным методом анализа кариотипа остается техника G - дифференциального окрашивания хромосом (G - бэндинг) , которую разработал в конце 1960-х годов Torbjorn Caspersson. В основе метода лежит приобретение хромосомами паттерна из светлых и темных полос по всей длине при обработке их трипсином с последующей окраской красителем Гимзы.
Характер исчерченности специфичен для каждой пары хромосом. Темные полосы (G - полосы, G - бэнды) образуются в местах локализации интерстициального гетерохроматина. Такие участки практически не содержат повторов ДНК, и они богаты А-Т - парами. В прометафазе, когда хромосомы находятся на ранней стадии конденсации, можно насчитать до 2000 полос, в других случаях - 400-800 полос. Этот способ окрашивания позволяет идентифицировать хромосомы, выявлять делеции, инверсии, инсерции, транслокации, фрагильные сайты и более сложные перестройки. Окрашиванию по G - методу предшествует предобработка цитогенетических препаратов. В зависимости от методики это может быть инкубация в буферах, не содержащих Ca2+ и Mg2+, при t° <= 37°С или t° >= 60°С; инкубация в растворах протеолитических ферментов (трипсин, пепсин и др.) ; инкубация с депротеинизирующими веществами (мочевина, 2-меркаптоэтанол) ; инкубация в стандартном солевом растворе (SSC) под воздействием щелочи и высокой температуры.
Существуют различные методики G - дифференциального окрашивания хромосом, но обычно используется GTG (предобработка трипсином, окрашивание красителем Гимзы). Воздействие трипсина обеспечивает переход регулярной спиралевидной структуры в нерегулярную сегментацию, что препятствует восприятию красителя Гимзы в G - негативных участках и усиливает его в G - позитивных сегментах хромосом.
R - метод позволяет получить поперечную исчерченность хромосом, обратную таковой при G - окрашивании (т. е. темным G - полосам соответствуют светлые R - полосы и наоборот). Препараты, полученные при R - окрашивании, анализируют, используя фазово - контрастную микроскопию. При получении R - исчерченности хромосом для предобработки используют сбалансированный солевой раствор Эрла при t° = 78 - 96°С, а также определенных значениях рН и времени экспозиции, которые отличаются в различных методиках.
Источник:
Разработан ряд методов окрашивания (бэндинга) , позволяющих выявить комплекс поперечных меток (полос, бэндов) на хромосоме. Каждая хромосома характеризуется специфическим комплексом полос. Гомологичные хромосомы окрашиваются идентично, за исключением полиморфных районов, где локализуются разные аллельные варианты генов. Аллельный полиморфизм характерен для многих генов и встречается в большинстве популяций. Выявление полиморфизмов на цитогенетическом уровне не имеет диагностического значения.
Q-окрашивание. Первый метод дифференциального окрашивания хромосом был разработан шведским цитологом Касперссоном, использовавшим с этой целью флюоресцентный краситель акрихин-иприт. Под люминесцентным микроскопом на хромосомах видны участки с неодинаковой интенсивностью флюоресценции - Q-сегменты. Метод лучше всего подходит для исследования Y-хромосом и потому используется для быстрого определения генетического пола, выявления транслокаций (обменов участками) между Х- и Y- хромосомами или между Y-хромосомой и аутосомами, а также для просмотра большого числа клеток, когда необходимо выяснить, имеется ли у больного с мозаицизмом по половым хромосомам клон клеток, несущих Y-хромосому.
G-окрашивание. После интенсивной предварительной обработки, часто с применением трипсина, хромосомы окрашивают красителем Гимзы. Под световым микроскопом на хромосомах видны светлые и темные полосы - G-сегменты. Хотя расположение Q-сегментов соответствует расположению G-сегментов, G-окрашивание оказалось более чувствительным и заняло место Q-окрашивания в качестве стандартного метода цитогенетического анализа. G-окрашивание дает наилучшие результаты при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы) .
R-окрашивание дает картину, противоположную G-окрашиванию. Обычно используют краситель Гимзы или флюоресцентный краситель акридиновый оранжевый. Этим методом выявляют различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.
С-окрашивание используют для анализа центромерных районов хромосом (эти районы содержат конститутивный гетерохроматин) и вариабельной, ярко флюоресцирующей дистальной части Y-хромосомы.
Т-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом. Эту методику, а также окрашивание районов ядрышковых организаторов азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) используют для уточнения результатов, полученных путем стандартного окрашивания хромосом.
humbio.ru/humbio/eclin/0023b879.htm –
med-endokrin.com/4.html –